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Apr 13, 2023

Strukturelle Hinweise auf Zwischenprodukte bei der O2-Bildung im Photosystem II

Naturband 617, Seiten

Nature Band 617, Seiten 629–636 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Bei der natürlichen Photosynthese bildet die lichtgetriebene Spaltung von Wasser in Elektronen, Protonen und molekularen Sauerstoff den ersten Schritt des Umwandlungsprozesses von Sonnenenergie in chemische Energie. Die Reaktion findet im Photosystem II statt, wo der Mn4CaO5-Cluster zunächst vier Oxidationsäquivalente speichert, die S0- bis S4-Zwischenzustände im Kok-Zyklus, die nacheinander durch photochemische Ladungstrennungen im Reaktionszentrum erzeugt werden, und dann die Chemie der O-O-Bindungsbildung katalysiert1, 2,3. Hier berichten wir über Raumtemperatur-Schnappschüsse mittels serieller Femtosekunden-Röntgenkristallographie, um strukturelle Einblicke in den letzten Reaktionsschritt von Koks photosynthetischem Wasseroxidationszyklus zu liefern, dem S3→[S4]→S0-Übergang, bei dem O2 gebildet wird und Koks Wasseroxidationsuhr zurückgesetzt wird . Unsere Daten offenbaren eine komplexe Abfolge von Ereignissen, die im Mikro- bis Millisekundenbereich ablaufen und Veränderungen am Mn4CaO5-Cluster, seinen Liganden und Wasserwegen sowie die kontrollierte Protonenfreisetzung durch das Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk des Cl1-Kanals umfassen. Wichtig ist, dass das zusätzliche O-Atom Ox, das als Brückenligand zwischen Ca und Mn1 während des S2→S3-Übergangs4,5,6 eingeführt wurde, parallel zur Yz-Reduktion ab etwa 700 μs nach dem dritten Blitz verschwindet oder sich verlagert. Der Beginn der O2-Entwicklung, angezeigt durch die Verkürzung des Mn1-Mn4-Abstands, erfolgt bei etwa 1.200 μs, was auf das Vorhandensein eines reduzierten Zwischenprodukts, möglicherweise eines gebundenen Peroxids, hinweist.

Die serielle Femtosekunden-Röntgenkristallographie an Freie-Elektronen-Röntgenlasern (XFELs)7 ermöglichte es uns, Kristallographiedaten des Photosystems II (PS II) in Echtzeit zu sammeln, während die Reaktion bei physiologischer Temperatur fortschreitet. Die durch vier Photonen induzierte Wasseroxidationsreaktion in PS II (Abb. 1a, b) wurde mit mehreren sichtbaren Laserblitzen eingeleitet. Mithilfe dieser Fähigkeit wurden intermediäre S-Zustandsstrukturen (S0, S1, S2 und S3) untersucht4,5,8,9,10, die die strukturellen Veränderungen des sauerstoffentwickelnden Komplexes (OEC) von PS II, der eine Funktion darstellt, aufdeckten Einheit bestehend aus dem Mn4CaO5-Cluster und seiner Wasser-Ligand-Umgebung (Abb. 1c, d)2,11. Kürzlich haben wir Schnappschussdaten zu mehreren Zeitpunkten während des S2→S3-Übergangs gesammelt, dem Schritt, bei dem ein Substratwasser in den Cluster eingeführt wird. Die Studie6 legte die Abfolge der Mn-Oxidation nahe, den Einbau einer zusätzlichen Sauerstoffbrücke (Ox oder O6 bei Suga et al.10) zwischen der offenen Koordinationsstelle an Mn1 und Ca (Bildung von Mn4CaO5-Ox in S3), dem potenziellen Eintrittsweg für das Substrat Wasser und die Protonenfreisetzung mit ihrem Gating-Mechanismus6,12. Die XFEL-Studien haben auch eindeutig gezeigt, dass die elektronische und geometrische Struktur des durch diese Messungen erhaltenen OEC unter den verwendeten Bedingungen nicht durch Röntgenphotoelektronen beeinflusst wird6,8,13.

a: Die Struktur von PS II mit den in die Membran eingebetteten Helices und den membranextrinsischen Regionen auf der Lumenseite von PS II, dargestellt in Grau. Die wichtigsten Elektronentransferkomponenten sind farbig dargestellt, darunter die Reaktionszentren Chlorophylle (P680), Phäophytine, Akzeptorchinone QA und QB, redoxaktives Tyrosin Yz und der katalytische Mn4CaO5-Cluster. Der Yz- und der Mn4CaO5-Cluster sind die Cofaktoren der Elektronendonorstelle. b, Kok-Zyklus der Wasseroxidationsreaktion, die an der Donorstelle stattfindet und sequentiell durch Ladungstrennungen im Reaktionszentrum P680 angetrieben wird, die durch die Absorption von Photonen (Nanosekunden-Lichtblitze, 1F–4F) im Antennensystem von PS II induziert werden. Röntgenkristallographiedaten bei Raumtemperatur wurden zu den angegebenen Zeitpunkten während des S3→S0-Übergangs gesammelt. c,d, Die Struktur des OEC in den Zuständen S3 (c) und S0 (d) und die Abfolge der zwischen ihnen auftretenden Ereignisse. Mn, lila; Ca2+, grün; Oh, rot. W1, -2, -3 und -4 sind Wasserliganden von Mn4 und Ca. Die relevanten Kanäle für den Wasser- und Protonentransfer (O1, O4 und Cl1) werden als rot, blau bzw. grün schattierte Bereiche angezeigt. Die gepunkteten Kreise markieren strukturelle Unterschiede zwischen den S3- und S0-Zuständen.

In der aktuellen Studie untersuchen wir den Sauerstoffentwicklungsschritt des Wasseroxidationszyklus von Kok (Abb. 1b), den S3→[S4]→S0-Übergang (Abb. 1c, d). In dunkeladaptierten PS II-Proben wird dieser Übergang durch den dritten sichtbaren Laserblitz eingeleitet. Der OEC wird in diesem Schritt vom All-Mn(IV)-S3-Zustand zum vorgeschlagenen hochreaktiven S4-Zustand mit den formalen Oxidationsstufen Mn(IV)4O⦁ oder Mn(IV)3(V) oxidiert. Dies initiiert die Bildung von O-O-Bindungen und die Freisetzung von O2, und die nun freie Bindungsstelle wird durch ein neues Wassersubstrat gefüllt, das die niedrigste Oxidationsstufe des Clusters (S0) bildet. Dieser mehrstufige Prozess, der auch die Freisetzung von zwei Protonen beinhaltet, hat die längste Zeitkonstante unter den S-Zustandsübergängen und seine Kinetik hängt von der Spezies und der Probenvorbereitung ab14,15,16,17,18,19.

Um strukturelle Einblicke in diesen komplexen Reaktionsschritt und insbesondere in das wichtige Zusammenspiel zwischen dem Mn4CaO5-Cluster und seiner Protein-Wasser-Umgebung (Abb. 1c, d) zu erhalten, haben wir zu sieben verschiedenen Zeitpunkten während des S3 Kristallographiedaten von PS II bei Raumtemperatur gesammelt →S0-Übergang, im Bereich von 50 μs bis 4 ms nach Einleitung dieses Übergangs (Abb. 1b). Alle Datensätze haben Auflösungen zwischen 2,00 und 2,16 Å (Erweiterte Datentabellen 1 und 2).

Der S3-Zustand wurde durch Beleuchtung dunkeladaptierter PS II-Mikrokristalle mit zwei in situ sichtbaren Nanosekunden-Laserblitzen (2F in Abb. 1b)4 bevölkert, wobei das Intervall zwischen den Blitzen 200 ms betrug, um die QA- und QB-Kinetik des Akzeptorchinons zu berücksichtigen S-Zustandsübergänge effizient vorantreiben. Die Zeitpunkte zwischen den Zuständen S3 und S0 wurden erzeugt, indem der dritte sichtbare Pumplaserblitz mit verschiedenen Verzögerungszeiten (Δt) abgegeben wurde, bevor die Kristalle dem Femtosekunden-XFEL-Puls ausgesetzt wurden (die Zeitmarkierungen in Abb. 1b). Während unser Beleuchtungsprotokoll die höchstmögliche Population bestimmter S-Zustände erreicht, kommt es aufgrund intrinsischer PS II-spezifischer Ineffizienzen („Fehler“) zu einer stärkeren Vermischung von S-State-Populationen mit zunehmender Blitzzahl (Methoden)20. Wir modellieren diese Verteilung in einem Mehrkomponentenmodell während der Strukturverfeinerung, wobei die „primäre“ Komponente die Zentren sind, die vom S3- in den S0-Zustand übergehen. Die „sekundären“ und „tertiären“ Komponenten sind die bekannten Start- und Endpunkte: zum Beispiel die abnehmende S3-Bevölkerung und bei längeren Verzögerungszeiten die zunehmende S0-Bevölkerung aus Zentren, die den Übergang abgeschlossen haben (Tabelle 3 zu Methoden und erweiterten Daten enthält Einzelheiten). ). Wir stellen fest, dass die Hauptkomponente zu jedem Zeitpunkt aus einer Mischung mehrerer Strukturen bestehen kann, die Zwischenstufen zwischen S3 und S0 sind. Alle unten diskutierten Ergebnisse entsprechen diesen verfeinerten Primärkomponenten aus Monomer I (Ketten, die in den hinterlegten Strukturen in Großbuchstaben angegeben sind).

Abbildung 2 zeigt die Auslassungskartendichte ausgewählter Atome am OEC und seiner Umgebung der verfeinerten Population zu den Zeitpunkten (Δt = 250, 500, 730, 1.200 und 2.000 μs) nach dem dritten Blitz (wir verwenden die Nomenklatur von 3F( Δt μs)). Um die Abfolge der Ereignisse während des S3→[S4]→S0-Übergangs zu visualisieren, verfolgen wir die Änderungen in drei Bereichen: Yz und D1-H190 (Abb. 2a, b) und Ox und O5 (Abb. 2c) sowie die Wasserliganden W1–W4 (Abb. 2d) und zwei Carboxylatliganden des Mn4CaO5/Mn4CaO5-Ox-Clusters, die eine Brücke zwischen Mn und Ca bilden (Abb. 2e). Darüber hinaus sind in Abb. 3 ausgewählte atomare Abstandsänderungen dargestellt, einschließlich der früheren (50 μs) und späteren (4.000 μs) Zeitpunktdaten.

a, Reste D1-Y161 (Yz) und D1-H190. Die Auslassungskarte aus der S3-Zustandsreferenz wird zum Vergleich mit den Zeitpunktdaten (blau) hellbraun dargestellt. b, Eine vereinfachte Darstellung der in der Yz-Region beobachteten Strukturänderungen. c, Ohne Dichte der Atome O5 und Ox des OEC. d, Ohne Dichte der Atome O5 und der terminalen Wasserliganden W1, W2, W3 und W4 des OEC. e, Dichte der Carboxylat-Sauerstoffatome von D1-E189 und D1-D170 weglassen. Alle in a und c–e gezeigten Auslassungskarten wurden durch individuelles Weglassen des interessierenden Atoms oder Rests generiert, und es wurde nur die Primärkomponente (d. h. der Zustand, der zu S0 vorrückt) verwendet. Bemerkenswerte Merkmale werden durch rote Pfeile und einen schwarzen gestrichelten Kreis hervorgehoben. Alle gezeigten Auslassungskarten sind bei 2,5σ, 3σ und 4σ konturiert, wobei zur einfacheren Visualisierung das in d annotierte Farbschema verwendet wird. Siehe auch Zusatzinformationsvideo 1.

Alle Entfernungen werden von der verfeinerten Komponente jedes Zeitpunkts übernommen (d. h. dem Zustand, der in den S0-Zustand übergeht). Fehlerbalken werden aus der unter „Methoden“ beschriebenen End-/Schnellannäherung berechnet und stellen eine Obergrenze dar. Die Daten werden hier als Mittelwerte ± Standardabweichung angezeigt. Die Fehlerbalken für jeden Zeitpunkt wurden aus n = 100 unabhängigen END/RAPID-Verfeinerungen erhalten. Weitere Details zur END/RAPID-Prozedur finden Sie unter Methoden. Gestrichelte Pfeile in den Schaltplänen des OEC rechts zeigen die Lage der einzelnen Entfernungen an. Mn wird als violette Kugeln und O als rote Kugeln dargestellt.

Der Abstand zwischen Yz und D1-H190 wurde zuvor als Indikator für den Oxidationszustand von Yz6 ermittelt. Im reduzierten Zustand führt eine starke Wasserstoffbrücke zwischen Yz und D1-H190 zu einem kurzen Abstand von etwa 2,6 Å. Bei der Oxidation von Yz durch P680+ wird das phenolische Proton von Yz auf D1-H190 übertragen, der Abstand vergrößert sich auf 2,8 Å und es wird eine Bewegung der His-Ringebene beobachtet (Abb. 2b). Unsere Daten zeigen, dass der Abstand zwischen den S3-Daten und dem ersten Zeitpunkt (50 μs) bereits zunimmt, was darauf hindeutet, dass Yz zu diesem Zeitpunkt vollständig oxidiert ist (Abb. 3). Danach bleibt dieser Abstand bis 500 μs konstant und erreicht zwischen 730 und 1.200 μs wieder das Grundniveau. Somit zeigen die Daten, dass die \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\)-Reduktion durch den Mn4CaO5-Ox-Cluster erst nach etwa 500 μs beginnt (Erweiterte Datentabelle 4)16,21,22 und scheint zum Zeitpunkt von 1.200 μs abgeschlossen zu sein. Zusätzliche Abstandsänderungen zwischen Yz und His190 werden bei 2.000 und 4.000 μs beobachtet, was möglicherweise auf die Neuanordnung des Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerks im Zusammenhang mit der letzten Protonenfreisetzung zurückzuführen ist, derzeit jedoch nicht genau verstanden wird. Interessanterweise wurde zuvor in zeitaufgelösten Kristallographiedaten des violetten bakteriellen Reaktionszentrums eine Verschiebung der Position eines Tyr-Rests neben dem speziellen Paar Chl bei Lichtanregung festgestellt und als Folge einer Änderung der Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen dieses Zentrums interpretiert Tyr bei Deprotonierung23.

Der zusätzliche Sauerstoff Ox, der im S3-Zustand vorhanden ist, geht bei der S0-Bildung verloren, was darauf hindeutet, dass Ox an der O-O-Bindungsbildung beteiligt sein könnte und Änderungen in seiner Dichte wahrscheinlich über den Beginn dieses Prozesses entscheiden. Um die Ox-Population zu verfolgen, wurde Ox aus dem OEC-Modell eliminiert, und seine Auslassungskartendichte ist in Abb. 2c dargestellt. O5 wurde separat weggelassen, um einen Vergleich ihrer Dichten zu ermöglichen (siehe auch Erweiterte Daten, Abb. 1). Die Ox-Omit-Dichte wird ab 250 μs asymmetrisch, mit einer deutlichen Intensitätsabnahme nach 500 μs und einem Absinken auf den Rauschpegel zwischen 1.200 und 2.000 μs, und Ox kann nur mit einer Population von weniger als 20 % in den 2.000 μs modelliert werden Zeitpunkt. Die Ox-Intensitätsänderungen treten gleichzeitig mit der \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\)-Reduktion auf, was darauf hinweist, dass die O-O-Bindungsbildung dazwischen stattfindet 500 und 1.200 μs. Während des gesamten S3→[S4]→S0-Übergangs bleibt die O5-Dichte annähernd konstant, mit Ausnahme einer Abnahme der Elektronendichte bei 1.200 μs.

Weitere Indikatoren für das Vorhandensein von Ox im Cluster sind Mn-Mn-Abstände. Wie bereits berichtet, vergrößert sich der Mn1-Mn4-Abstand während des S2→S3-Übergangs aufgrund der Insertion von Ox (Lit. 6). Abbildung 3 zeigt, dass der Mn1-Mn4-Abstand in den 3F-Strukturen bis 1.200 μs verlängert bleibt (Methods verfügt über eine detailliertere Analyse) und dann über die nächsten 3 ms abnimmt, um den gleichen Wert wie in den Zuständen S1 und S2 zu erreichen. Ein ähnlicher Trend ist auch beim Mn1–Mn3-Abstand zu beobachten. Daher gibt es eine Verzögerung zwischen dem Beginn der O-O-Bindungsbildung (500–730 μs basierend auf den für Yz und Ox beobachteten Änderungen) und dem Zeitpunkt, zu dem die Mn-Mn-Abstände abzunehmen beginnen (1.200 μs). Der Befund weist darauf hin, dass in diesem Zeitraum wahrscheinlich ein Wasseroxidationszwischenprodukt vor der Freisetzung von O2 vorliegt.

Für die Omit-Map-Dichte der Wasserliganden W1–W4 werden Veränderungen in Form und Intensität beobachtet, die in Abb. 2d dargestellt sind. Insbesondere wird bei 250 μs eine leichte Verlängerung der O5-Dichte in Richtung W2 und eine leichte Verlängerung der W4-Dichte in Richtung W3 beobachtet. Dieser letztere Trend setzt sich fort und bei 500 μs ist eine Überlappung der W3- und W4-Dichten mit einem mFobs − DFcalc-Peak (Fobs und Fcalc sind die experimentellen bzw. Modellstrukturfaktoren, während m und D Gewichtungsfaktoren sind) bei 2,5 zu sehen σ zwischen W3 und W4 (Extended Data Abb. 2). Gleichzeitig wird die W1-Dichte in Richtung D1-D61 und W19 erweitert, was auf eine höhere Mobilität von W1 hinweist. Wir spekulieren, dass alle diese Bewegungen mit der Deprotonierung des OEC und dem Protonentransfer in Richtung des Cl1-Kanals zusammenhängen (siehe nächster Abschnitt und Abb. 4).

a: Der Endpunkt des O1-Kanals in der Nähe des OEC, der die Gruppe von fünf Gewässern (W26–W30) in dieser Region umfasst. Überlagert ist die 2mFobs − DFcalc-Elektronendichtekarte mit Konturen bei 0,8σ, 1,0σ und 1,5σ. b, Die O4- und Cl1-Kanäle (Zweig A), die die Region D1-D61 und D1-E65/D2-E312 umfassen, die vermutlich als Protonentor fungiert. Überlagert sind mFobs − DFcalc-Karten für W1, W2 und D61, die bei 2,5σ, 3,0σ und 4,0σ angezeigt werden. Ebenfalls gezeigt ist die Fobs(Zeitpunkt) − Fobs(2F)-Differenzdichtekarte innerhalb eines 1,5-Å-Radius von W19/W20/W48 im O4-Kanal bei 3σ (orangefarbene Karte). Der beobachtete Rotationswinkel an der Seitenkette von E65 zu bestimmten Zeitpunkten wird in Bezug auf die entsprechende Seitenkettenposition im 2F-Zustand berechnet. Wichtige Änderungen werden durch einen Pfeil oder einen gestrichelten Kreis hervorgehoben. Alle Gewässer werden durch ihre B-Faktoren gemäß dem in der Abbildung gezeigten abweichenden Farbschema gefärbt. Wichtige Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen werden mit einem binären Farbschema angezeigt, um die Stärke anzuzeigen (Abstand < 2,8 Å ist rot und 2,8–3,2 Å ist grau).

Bei 730 μs werden die O5-, W2- und W3-Dichten anisotrop und weisen alle auf einen Bereich zwischen diesen drei Sauerstoffatomen hin (Abb. 2d), was auf eine erhöhte Mobilität dieser Liganden hinweist. Gleichzeitig ist auch die Ox-Dichte stark anisotrop. Diese Bewegung aller vier Sauerstoffatome hängt wahrscheinlich mit der Bildung des Wasseroxidationszwischenprodukts zusammen. Wir weisen darauf hin, dass für eine genaue Modellierung der Ox-Position Daten mit höherer Auflösung erforderlich sind. Bei 1.200 μs werden die Dichten für alle terminalen Wasserliganden (W1–W4) und das verbrückende O5 am schwächsten. Ein Vergleich dieser Omit-Map-Dichten innerhalb des OEC mit denen des O2-Atoms, von dem angenommen wird, dass es im S3→S0-Schritt keine herausragende Rolle spielt, zeigt, dass die Verringerung der Dichte spezifisch für diese fünf Atome (W1–W4) ist und O5) und Ox (Extended Data Abb. 1). Die Überlappung der O5-, W2- und W3-Dichten ist bei 1.200 μs nicht mehr zu beobachten.

2.000 μs nach dem dritten Blitz ist die O5-Auslassungskartendichte im Vergleich zu den Zuständen S3 und S0 deutlich wiederhergestellt, aber die Auslassungskartendichten der Gewässer W1–W4 haben noch kein ähnliches Niveau erreicht und bleiben verlängert. Wir stellen eine ähnliche Überlappung von W1/W2 fest, die bei 500 μs beobachtet wurde. Dies könnte auf den Beginn der zweiten Protonenfreisetzung hinweisen, die bekanntermaßen beim S3→S0-Übergang auftritt, nach der Bindung von Wasser, das die durch die O2-Freisetzung gebildete freie Stelle wieder auffüllt21,24,25. Interessanterweise bleibt die längliche Form der W3-Dichte auch im S0-Zustand bestehen, den wir zuvor mit zwei möglichen Positionen von W3 modelliert haben (Lit. 4).

Abbildung 2e zeigt, dass die Liganden D1-D170 und D1-E189, die beide eine Brücke zwischen Mn und Ca bilden, ihre Konformation während der O2-Bildung und -Freisetzung ändern. In Übereinstimmung mit der hohen Mobilität, die für die Wasserliganden W1 und W2 beobachtet wurde, scheint die Verbindung zwischen D1-D170 und Ca zwischen 730 und 2.000 μs geschwächt zu sein und wird erst im S0-Zustand (3F (200 ms)) vollständig wiederhergestellt.

Von 1.200 bis 4.000 μs treten mehrere Strukturänderungen auf, die bei der Bildung des stabilen S0-Zustands (3F(200 ms)) wieder rückgängig gemacht werden. Dazu gehören die Vergrößerung der Yz-D1-H190-, Ca-D1-E189- und Mn4-O5-Abstände sowie eine Verringerung der Mn1-Mn4- und Mn1-Mn3-Abstände. Die meisten dieser Veränderungen deuten auf die O2-Freisetzung und/oder den Wassereintrag über das Ca-Ion26,27 hin, möglicherweise aus dem O1-Kanal (siehe unten). Dies deutet darauf hin, dass die O2-Freisetzung und das Wiederauffüllen des Clusters durch große Wassermengen sowie das Zurücksetzen des katalytischen Zentrums über einen längeren Zeitraum erfolgen.

PS II verfügt über mehrere hydrophile Kanäle, die sich vom OEC bis zur Lumenseite der Thylakoidmembran erstrecken11,28,29,30,31, und einige davon spielen vermutlich eine entscheidende Rolle beim Transport von Protonen und Substratwasser während des Katalysezyklus ( O1-, O4- und Cl1-Kanäle sind in Abb. 1)24,32,33 dargestellt. In unserer jüngsten Untersuchung des S2→S3-Übergangs12 haben wir den O1-Kanal, der sich von O1 und Ca des OEC bis zur Masse erstreckt, als Substratwasserkanal und den Cl1-Kanal, der sich von W1 und W2 des OEC erstreckt, als Substratwasserkanal zugeordnet OEC zur Masse, um ein Protonenfreisetzungskanal während des S2→S3-Übergangs zu sein6. Der S3→S0-Übergang beinhaltet auch die Einfügung eines Substratwassers in die OEC und die Freisetzung von zwei Protonen an die Masse; Es wurde vermutet, dass ein Proton vor der O-O-Bindungsbildung freigesetzt wird und das andere nach der erneuten Bindung eines Wassermoleküls an die OEC24,25,34.

Abbildung 4 zeigt die Zeitpunktdaten für die O1- und Cl1/O4-Kanäle in der Nähe des OEC während des S3→S0-Übergangs. Die Elektronendichte der Wassermoleküle im O1-Kanal in der Nähe des OEC ändert sich erheblich, wie in den 2mFobs − DFcalc-Karten (Abb. 4a) gezeigt, ähnlich wie es während des S2→S3-Übergangs beobachtet wurde6. Die Wässer W27, W28 und W32 (Ergänzungstabelle 1 enthält die Wassernummerierung) haben im Vergleich zu den stabileren Wässern wie W29 (B-Faktor von etwa 37) eine niedrige Elektronendichte und hohe B-Faktoren (ca. 50 Å2) (Erweiterte Daten, Abb. 3). Å2), insbesondere bei 1.200 μs. Wir interpretieren dies als Hinweis auf die hohe Mobilität dieser Wässer und vermuten, dass diese Region als Einlass für das Substratwasser dienen könnte, das den OEC nach der Freisetzung von molekularem Sauerstoff wieder auffüllt12. Wir schlagen daher vor, dass PS II den O1-Kanal für die Substrataufnahme sowohl bei den S2→S3- als auch bei den S3→S0-Übergängen nutzt. In der Gruppe der fünf Wässer (W26–30) („Wasserrad“ in Lit. 6) weist W26 während des gesamten Übergangs eine hohe Elektronendichte auf, mit einer deutlich erhöhten Dichte bei 500 μs. Da sich W26 innerhalb der Wasserstoffbrückenbindungsentfernung zu O1 des OEC befindet, kann diese Wechselwirkung für den Ladungsausgleich im Cluster wichtig sein, wenn das OEC den letzten Oxidationsschritt (d. h. die Bildung des S4-Zustands) und die anschließende Vier-Elektronen-Phase durchläuft Reduktion zum S0-Zustand.

Veränderungen werden auch im Cl1-Kanal beobachtet. Bei 250 μs dreht sich der D1-E65-Rest um 19° in Richtung W40, was zu einer Verkürzung des Abstands zwischen D1-E65 und W40 um 0,3 Å führt (Abb. 4b). Zu diesem Zeitpunkt beginnt die Ox-Dichte asymmetrisch zu werden, was bei 500 μs noch ausgeprägter ist (Abb. 2c). Bei 500 μs verlängert sich auch die Dichte der W1-Auslassungskarte in Richtung des Bereichs D1-D61 und W19 (Abb. 4b). Dies geht einher mit einer Abnahme der D1-D61-Carboxylat-Sauerstoffdichte, die sich innerhalb des Wasserstoffbrückenbindungsabstands von W40 befindet, und einer Verkürzung des Abstands zwischen W40 und D1-E65 um 0,5 Å aufgrund der Drehung (25°) der Seitenkette. Infolgedessen wird ein kontinuierliches Wasserstoffbindungsnetzwerk gebildet, das den OEC mit der Region D1-E65/D2-E312 verbindet. Wir spekulieren, dass die Änderungen mit dem ersten Protonentransfer vom OEC zum Cl1-Kanal zusammenhängen. Diese Änderungen werden bis zum Zeitpunkt von 730 μs umgekehrt (Abb. 4b). Ein frühes Deprotonierungsereignis wurde auch durch andere Studien mit anderen Methoden nahegelegt, mit Zeitkonstanten im Bereich von 50 bis 300 μs (d. h. vor dem letzten Oxidationsereignis, der vorübergehenden Bildung des S4-Zustands)15,16,17,21,24 ,34,35.

Bei 1.200 μs rotiert der D1-E65-Rest während dieses Übergangs zum zweiten Mal in Richtung W40, begleitet von einer Verkürzung des W42-D1-E65-Abstands um 0,4 Å. Somit wird zu diesem Zeitpunkt ein Wasserstoffbindungsnetzwerk vom OEC zum D1-E65/D2-E312-Bereich neu gebildet, ähnlich dem, was wir bei 500 μs beobachtet haben. Der Abstand D1-E65/D2-E312 vergrößert sich von etwa 2,6 auf etwa 3,2 Å, was auf eine erhebliche Abschwächung der Wechselwirkung hinweist und wahrscheinlich eine Konfiguration bildet, die das nächste Proton aufnehmen kann. Diese Änderung fällt mit dem Zeitpunkt zusammen, zu dem die Ox-Elektronendichte in der Auslassungskarte (Abb. 2) unter das Nachweisniveau sinkt und die W28-, W27- und W32-Dichten im O1-Kanal abnehmen (Abb. 4a). Wir interpretieren diese Reihe von Änderungen so, dass sie mit dem Beginn des Wiederherstellungsprozesses des Mn4CaO5-Clusters zusammenhängen (d. h. eingeleitet durch den Einbau von Wasser in den OEC zusammen mit einer Deprotonierung). Bei 2.000 und 4.000 μs wird die Seitenkette von D1-E65 um fast 40° von ihrer Position in der S3-Struktur in Richtung W119 gedreht (Abb. 4b). Der Abstand D1-E65–W119 beträgt etwa 2,5 Å, was auf ein gemeinsames Proton oder eine sehr enge Wechselwirkung zwischen diesen beiden Gruppen hindeutet. D1-R334 bewegt sich ebenfalls um 20° und bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit W41.

Die Veränderungen rund um die D1-E65/D2-E312-Region weisen auf die Protonenfreisetzung in die Masse hin, da sie an das erinnern, was wir für die Protonenfreisetzung während des S2→S3-Übergangs beobachtet haben12. Beim S3→S0-Übergang nehmen wir an, dass die früheren Änderungen dieser Region (250–730 μs) mit dem ersten Protonentransfer und die späteren Änderungen (1.200–4.000 μs) mit dem zweiten Protonentransfer vom OEC zusammenhängen zur Masse, durch D1-D6136,37 über die Drehung von D1-E65. Das aktuelle Ergebnis legt daher nahe, dass die Region D1-E65/D2-E312 während des S3→S0-Übergangs zweimal als Tor für die Protonenfreisetzung fungiert.

W20, das über W19 im O4-Kanal ein dichtes Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk mit O4 bildet, verschwindet während des S1→S2-Übergangs und erscheint im S0-Zustand4 wieder. Seine Rückkehr während des S3→S0-Übergangs ist daher ein Indikator für die vollständige Wiederherstellung des S0-Zustands. Der erste klare Hinweis auf die Rückkehr von W20 findet sich in der Differenzkarte Fobs(4.000 μs) − Fobs(2F) (orangefarbene Dichte in Abb. 4b) und wurde bei 40 % Belegung in der verfeinerten 4.000-μs-Komponente modelliert. Dies impliziert, dass die W20-Wiederherstellung in der späteren Phase der OEC-Erholung erfolgt.

Die Schnappschüsse der Strukturen von PS II während des S3→S0-Übergangs zeigen die Abfolge und den Verlauf der einzelnen Ereignisse an mehreren Orten mit unterschiedlichen Zeitkonstanten. Die strukturellen Veränderungen können grob in vier Abschnitte mit unterschiedlichen Eintrittszeiten und Kinetiken eingeteilt werden, wie in Abb. 5 dargestellt; Dabei handelt es sich um die Redoxzustandsänderungen von Yz, die erste Deprotonierung, OEC-Oxidation und O2-Bildung sowie die vollständige Wiederherstellung und Neueinstellung der Kok-Uhr im S0-Zustand.

Die Abfolge der Ereignisse (i–iv), die zum ersten Deprotonierungsereignis, der Freisetzung von molekularem Sauerstoff, dem Wassereintrag und dem zweiten Deprotonierungsereignis führen. Die OEC-Atome sind in Lila (Mn), Grün (Ca) und Rot (O) dargestellt. Der O1-Kanal wird rot dargestellt, der O4-Kanal blau und der Cl1-Kanal grün. Die Liganden des OEC und die Reste, die die Wasser-Protonen-Kanäle bilden, sind basierend auf der Untereinheit, zu der sie gehören, gefärbt (D1, blau; D2, grün). Mögliche Wege für die Übertragung von Protonen (cyanfarbener Pfeil), Wasser (roter gestrichelter Pfeil), Sauerstoff (roter durchgezogener Pfeil) und Elektronentransfer (grüner Pfeil) sind dargestellt. Bemerkenswerte Merkmale werden durch schwarze Pfeile hervorgehoben. Der rechte hellbraune Kasten zeigt die vorgeschlagenen Modelle (Modell a und Modell b) für die O-O-Bindungsbildung. Magenta hervorgehobener Sauerstoff zeigt die Kandidatenatome für die O-O-Bildung an.

Im S3-Zustand liegen alle vier Mn formal in der Oxidationsstufe (+IV) vor. Wir stellen fest, dass in der Literatur eine Oxidation des Liganden anstelle von Mn (Bildung von Oxyl oder einer Oxo-Oxyl-Bindung) während des S2→S3-Übergangs vorgeschlagen wurde5, dies steht jedoch nicht im Einklang mit der Röntgenemissionsspektroskopie bei Raumtemperatur (XES). ) Daten, die die Oxidation von Mn6,13 zeigen. Beim dritten Blitz erfolgt die Oxidation von Yz durch Abgabe eines Elektrons an P680+ nach der Ladungstrennung an den Chlorophyllen des Reaktionszentrums. Im Vergleich zum S3-Zustand wird in 3F (50 μs) eine Abstandszunahme zwischen Yz und D1-H190 beobachtet (Abb. 3 und 5(i)). Diese Änderung wird der Bildung von \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) zugeschrieben, die bekanntermaßen innerhalb von 30 μs nach der Photoanregung auftritt38, und damit verbundene Protonentranslokation zwischen \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) und D1-H190.

Die Bildung von \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) löst das erste Deprotonierungsereignis aus, das wahrscheinlich im Zeitraum von 200–500 μs liegt15,16 ,17,24,34,39. Wir beobachteten den Beginn der Rotation von D1-E65, von dem angenommen wird, dass es Teil des Protonentors ist, und die Bildung des Wasserstoffbrückenbindungswegs vom OEC zu dieser Region bei 250 μs. Zusammen mit diesen Änderungen treten die Elektronendichten bei W1 und D61 bei 500 μs stärker hervor (Abb. 2d und 4b), was möglicherweise mit einer Protonenfreisetzung aus dem OEC an die Protonen-Gate-Reste D1-E65 und D2-E312 zusammenhängt (Abb. 5(ii)).

Im frühen Stadium des Zeitraums von 500 bis 1.200 μs erfolgt das letzte Oxidationsereignis (vorübergehende S4-Zustandsbildung mit Mn(IV)4O⦁ oder Mn(IV)3(V)) und anschließend die Reduktion von Mn erfolgt (Abb. 5(iii)). Die O-O-Bindungsbildung sollte durch dieses letzte Oxidationsereignis des OEC in den möglicherweise kurzlebigen S4-Zustand ausgelöst werden. Die Abstandsänderung, die wir für Yz–D1-H190 zwischen 500 und 730 μs beobachten, legt nahe, dass die Verringerung von \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox} }\) findet während dieser Zeit durch den Elektronentransfer vom OEC zum Yz statt. Nach der vorübergehenden Bildung von S4 kann die Vier-Elektronen-Reduktion in einem Schritt mit der Bildung der O-O-Bindung und der sofortigen Freisetzung von O2 oder in zwei Schritten mit der Anwesenheit eines Zwischenprodukts vor der Freisetzung von molekularem Sauerstoff aus dem OEC ablaufen. Im letzteren Fall erscheint am wahrscheinlichsten eine Peroxospezies, die durch eine anfängliche Zwei-Elektronen-Reduktion entsteht, als Zwischenprodukt.

Unsere Daten zeigen, dass es eine Verzögerung zwischen dem Beginn der O-O-Bindungsbildung (500–730 μs), wie durch den Abstand/Rotation Yz-D1-H190 angezeigt, und der Abnahme der Ox-Elektronendichte und dem Beginn der O2-Freisetzung gibt unterstützt durch die Mn1–Mn4-Abstandskontraktion (1.200 μs). Dieser Beginn der O2-Freisetzung steht auch im Einklang mit Studien zur O2-Entwicklung22,40. Die Verzögerung weist darauf hin, dass es einen Zwischenzustand gibt, möglicherweise eine peroxidähnliche Spezies, was auf den zweistufigen Elektronenreduktionsmechanismus hinweist.

Basierend auf theoretischen Studien wurden in der Literatur mehrere O-O-Bindungsbildungsstellen vorgeschlagen (Abb. 5)3,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Unter diesen sind O5–Ox aufgrund ihrer Nähe und der geringeren Belegung von O5 um etwa 1.200 μs am besten für unsere Daten geeignet (Abb. 5, Modell a). Zwei weitere Möglichkeiten, bei denen O5 entweder mit W2 oder W3 reagiert und Ox O5 ersetzt, können derzeit jedoch nicht ausgeschlossen werden (Abb. 5, Modell b). Während andere Mechanismen, an denen O5 nicht beteiligt ist, nicht ausgeschlossen werden können, gibt es in den aktuellen Daten keine eindeutigen Belege für diese Mechanismen.

Bei 1.200 μs liegt die Ox-Omit-Kartendichte unter dem Schwellenwert von 2,5σ, was darauf hinweist, dass sich ein überwiegender Anteil von Ox von seiner ursprünglichen Position im Cluster verschoben hat. Die Kontraktion der Mn1–Mn4- und Mn1–Mn3-Abstände zu diesem Zeitpunkt lässt darauf schließen, dass die O2-Freisetzung etwa zu diesem Zeitpunkt einsetzt. Sobald O2 freigesetzt wird, scheint die Wiederauffüllung des Clusters mit neuem Substratwasser sofort zu erfolgen. Dies basiert auf der Beobachtung, dass außer Ox keine Sauerstoffdichte fehlt, obwohl die ausgelassenen Kartendichten aller Endgewässer (W1–W4) und des Brücken-O5 bei 1.200 μs abgeschwächt sind. Die Daten belegen, dass die O2-Freisetzung und das Wiederauffüllen des Standorts stark koordiniert sind und wahrscheinlich über ein Endwasser erfolgen, das bereits an die OEC angeschlossen ist.

Sowohl bei 2.000 als auch bei 4.000 μs (Abb. 5 (iv)) liegt die Ox-Dichte innerhalb des Rauschpegels, was bedeutet, dass Mn1 überwiegend fünfkoordiniert wird. Mn4 ist sechsfach koordiniert, obwohl die Mn4-O5-Wechselwirkung schwach ist (2,2–2,3 Å), was darauf hindeutet, dass O5 ein Hydroxid sein könnte. Der Ca-D1-E189-Abstand ist zu diesen Zeitpunkten immer noch länger als im S0-Zustand. Weitere langsame Erholungen werden in der Yz-Region (Abb. 2b), dem „Wasserrad“ (Abb. 4a) und den Protonen-Gate-Regionen (D1-E65/D2-E312) (Abb. 4b) beobachtet. Wir nehmen an, dass ein Wasser aus der „Wasserrad“-Region im O1-Kanal, ähnlich dem S2→S3-Übergang6,12, den terminalen Wasserliganden des OEC ersetzt. Die Veränderungen in der Protonen-Gate-Region könnten auf die Deprotonierung des neu eingefügten Wassers hinweisen36. Gleichzeitig werden die Aminosäurekoordinationsumgebung, das Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk um den OEC und das Wasser in den Kanälen auf den S0-Zustand zurückgesetzt. Dazu gehört die Wiederherstellung von W20 im O4-Kanal, das vermutlich an der Protonenfreisetzung während des S0→S1-Übergangs beteiligt ist4,50.

In der aktuellen Studie offenbaren Raumtemperatur-Schnappschüsse von PS II-Strukturen bis zum letzten Schritt der Kok-Uhr (S3→[S4]→S0) Details der molekularen Prozesse der photosynthetischen Wasseroxidation. Bisher wurden diese Prozesse größtenteils auf der Grundlage kinetischer Studien interpretiert. Wichtig ist, dass die hier berichteten Ergebnisse experimentelle Belege für einen zweistufigen Reduktionsmechanismus des Mn4CaO5-Ox-Clusters nach der Bildung der O-O-Bindung und der O2-Freisetzung mit einem vorübergehenden Zwischenprodukt, höchstwahrscheinlich einem gebundenen Peroxid, liefern. Dies ist ein großer Schritt vorwärts zum Verständnis der Chemie der Wasseroxidationsreaktion. Die Ergebnisse zeigen auch, wie biologische Katalysatoren wie der OEC in PS II durch das Zusammenspiel zwischen dem Metallzentrum, der Proteinumgebung und dem Wassernetzwerk Multielektronen-/Multiprotonenreaktionen ermöglichen. Die aktive Rolle der Mikroumgebung in natürlichen Enzymen liefert Inspiration für die Steuerung solcher Reaktionen in künstlichen Photosynthesesystemen, die aus auf der Erde vorkommenden Elementen hergestellt werden können.

Die Röntgenbeugungsmessungen von 20 bis 60 µm großen Kristallen, die aus PS II-Dimeren von Thermosyncechococcus vestitus (früher Thermosyncechococcus elongatus genannt) hergestellt wurden, wurden in 100 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, pH 6,5, 100 mM Ammoniumchlorid durchgeführt und 35 % (Gew./Vol.) PEG 5000 (Ref. 51,52). PS II-Kristallsuspension mit einer Konzentration von etwa 0,5–1,2 mM Chlorophyll (Chl) wurde in eine Spritze (Gasdichte Spritze von Hamilton, 1 ml) geladen und vor der Datenerfassung 1 Stunde lang dunkel adaptiert. Membraneinlass-Massenspektroskopie (MIMS) wurde verwendet, um die O2-Entwicklung, Umsatzparameter und S-Zustandspopulationen zu bestimmen4,6. Die PS II-Kristalle zeigten laut XES- und Elektronenspinresonanzmessungen keine Mn(II)-Kontamination53 und zeigten eine Aktivität von 2500 ± 100 μmol O2 (mg(Chl) × h)−1.

Der akustische Tröpfchenausstoß54 wurde in Kombination mit der Drop-on-Tape-Probenabgabemethode55 verwendet. Um die stabilen Zwischenprodukte S2, S3 und S0 einzufangen, wurde jedes Tröpfchen der Kristallsuspension mit 120-ns-Laserimpulsen bei 527 nm unter Verwendung eines Nd:YLF-Lasers (Yttrium-Lithiumfluorid) (Evolution, Coherent) an der Linac Coherent Light Source beleuchtet ( LCLS) oder durch 8-ns-Laserimpulse bei 532 nm unter Verwendung einer Kombination aus zwei Nd:YAG-Lasern (Yttrium-Aluminium-Granat) (Minilite, Continuum) bei Spring-8 Angstrom Compact Free Electron Laser (SACLA) über drei fasergekoppelte Ausgänge mit eine Verzögerungszeit von 200 ms zwischen jeder Beleuchtung und von 200 ms zwischen der letzten Beleuchtung und der Röntgensonde, ähnlich wie zuvor, um die QA- und QB-Kinetik des Akzeptorchinons zu berücksichtigen und S-Zustandsübergänge effizient voranzutreiben4,6,55 . Wir haben ein Feedback-Kontrollsystem für die Bandgeschwindigkeit und die Abscheidungsverzögerung implementiert und die Blinkverzögerung und die Tröpfchenphase entsprechend angepasst55. Um Zeitverzögerungen von weniger als 200 ms zwischen Beleuchtung und Röntgensonde zu erreichen, wurde ein vierter „Freiraum“-Laser verwendet. Dabei handelte es sich entweder um einen Opolette 355 LD-Laser (Opotek, 530 nm Wellenlänge, 7 ns Pulsbreite) am makromolekularen Femtosekundenkristallographie/LCLS-Instrument oder um ein NT230 OPO-Lasersystem (530 nm Wellenlänge, 5 ns Pulsbreite, EKSPLA Co.). .) bei SACLA. Dieser Freiraumlaser wurde mit einer einstellbaren Verzögerung, die für diese Studie zwischen 50 und 4.000 μs eingestellt wurde, mit dem Röntgenpuls synchronisiert. Der Laser wurde mit einer Optik zum Röntgen-Wechselwirkungspunkt geführt und seine Position wurde für jede Verzögerungszeit fein abgestimmt, um sicherzustellen, dass die Laserpunktposition mit der Position des Probentröpfchens zum ausgewählten Verzögerungszeitpunkt übereinstimmt. An den XFELs wurde eine Lichtintensität von 120 ± 10 mJ pro cm2 angewendet, da sich herausstellte, dass die O2-Entwicklung bei den Abmessungen und Konzentrationen der in unseren Experimenten verwendeten Proben mit 70 mJ pro cm2 gesättigt war4. Eine Lichtintensität von 120 mJ pro cm2 entspricht etwa 140 Photonen, die pro PS II-Monomer in der vorderen 5-µm-Schicht des Kristalls absorbiert werden, und etwa 9 Photonen pro PS II-Monomer, wenn man von einer Dicke des Kristalls von 60 µm ausgeht (was der Fall ist). obere Größengrenze der in dieser Studie verwendeten Kristalle) für die hintere 5-µm-Schicht. Diese Photonendichte gewährleistet eine Sättigung über das gesamte Kristallvolumen, auch bei zwei übereinander gestapelten Kristallen im Laserstrahl. Bei einer minimalen Pulslänge von 5 ns und 35 Chl pro PS II-Monomer beträgt die verwendete Lichtintensität durchschnittlich 0,8 Photonen pro (Chl und Nanosekunde) für den vorderen Teil und 0,05 Photonen pro (Chl und Nanosekunde) für den hinteren Teil des Kristalls. Wenn ein PS II-Zentrum einer Ladungstrennung unterliegt, werden zusätzliche Photonen, die von der internen Antenne Chl absorbiert werden, schnell in Form von Fluoreszenz mit einer durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer von etwa 0,5–1 ns abgeführt, wodurch eine Übererregung des Reaktionszentrums oder eine Erwärmung verhindert wird Artefakte.

Die Kristallographiedaten wurden in verschiedenen Einrichtungen gesammelt. Einzelheiten sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Die experimentellen Strahlbedingungen und Detektorkonfigurationen, die zur Erfassung jedes Datensatzes verwendet wurden, sind ebenfalls tabellarisch aufgeführt. Die Probe wurde mithilfe des zuvor beschriebenen Drop-on-Tape-Aufbaus55 in den Röntgeninteraktionsbereich befördert. Die Beleuchtungsbedingungen für die Besetzung verschiedener S-Zustände sind in Lit. detailliert beschrieben. 4.

Die für die verschiedenen Beleuchtungszustände gesammelten Daten wurden mit dem Programm dials.stills_process mit einer Zieleinheitszelle von a = 117,0 Å, b = 221,0 Å, c = 309,0 Å, α = β = γ = 90° und der Raumgruppe P212121 verarbeitet . Am Rand des Detektors wurden Bragg-Spots integriert. Auf jeden integrierten Bragg-Punkt wurde eine Kapton-Absorptionskorrektur aufgrund des Förderbandes unseres Probenabgabesystems angewendet, wobei die Tröpfchengröße, die Banddicke, der Bandwinkel und die Position der Beugungspunkte auf dem Detektor in Bezug auf die Kristallposition berücksichtigt wurden . Vor der Integration haben wir auch eine Ensemble-Verfeinerung der Kristall- und Detektorparameter mit dem Programm cctbx.xfel.stripe_experiment durchgeführt, was nachweislich die Elementarzellenverteilung einschränkt und die endgültigen isomorphen Differenzkarten verbessert56. Schließlich wurden die Intensitäten mit dem Programm cctbx.xfel.merge zusammengeführt, das eine Auflösungsbegrenzung pro Bild und eine Filterung der Gitter unter Verwendung eines Elementarzellenschwellenwerts von 1 % des Referenzmodells anwendet. Um die Überlegungen zusammenzuführen, verwenden wir die in Ref. beschriebenen Best Practices. 57. Die Elementarzellen und die Anzahl der für jeden Datensatz zusammengeführten Gitter sind in den erweiterten Datentabellen 1 und 2 aufgeführt.

Die endgültigen zusammengeführten Datensätze wurden für 2F, 3F (50 µs), 3F (250 µs), 3F (500 µs), 3F (730 µs), 3F (1.200 µs), 3F (2.000 µs), 3F (4.000 µs) erfasst. und 3F(200 ms)-Zustände mit Auflösungen zwischen 2,16 und 2,0 Å, erhalten durch Zusammenführen von 6.659 und 39.199 Gittern (erweiterte Datentabellen 1 und 2). Die endgültigen zusammengeführten Datensätze vor der Modellerstellung wurden ebenfalls auf Basis jedes Auflösungsabschnitts auf einen Referenzdatensatz skaliert (in diesem Fall ist der Referenzdatensatz der im PDB-ID-Code 7RF1 veröffentlichte PS II-Datensatz)12. Dadurch können wir einen genaueren Vergleich von mFobs − DFcalc-Omit-Karten und 2mFobs − DFcalc-Karten zwischen verschiedenen Datensätzen durchführen.

Jeder Datensatz wurde unter Verwendung einer hochauflösenden PS II-Struktur (1,89 Å), die in einer früheren Arbeit veröffentlicht wurde (PDB-ID-Code 7RF1)12, als Ausgangspunkt mit dem Programm phenix.refine58 verfeinert. Die Verfeinerung erfolgt in mehreren Stufen. Zunächst werden die B-Faktoren des Ausgangsmodells auf 30 gesetzt und alle Wässer sowie die Atome des OEC entfernt. Eine anfängliche Verfeinerung des starren Körpers gekoppelt mit einer Verfeinerung der xyz-Koordinaten und isotropen B-Faktoren wurde über 15 Zyklen durchgeführt, um das Modell an die Elementarzelle anzupassen. Anschließend werden die OEC-Atome wieder hinzugefügt und über mehrere Zyklen mit benutzerdefinierten Bindungsbeschränkungen verfeinert. Wir verwenden bei der Verfeinerung auch maßgeschneiderte Bindungsbeschränkungen für Chlorophyll-a (um eine korrekte Platzierung des Mg relativ zur Ebene des Porphyrinrings zu ermöglichen) und unbekannte lipidähnliche Liganden (Sterinsäure). Nach der anfänglichen Verfeinerung des OEC + Protein-Komplexes wurden dem Modell Wasser hinzugefügt, wobei das phenix.refine-Wasserauswahlprotokoll sowie die manuelle Platzierung von Wasser über coot59 und die Durchführung mehrerer Verfeinerungszyklen zum Einsatz kamen.

Zu diesem Zeitpunkt teilen wir das Modell in der Nähe des OEC und des OEC selbst (nur Protein- und OEC-Atome) in mehrere Komponenten auf (erweiterte Datentabelle 3). Die Aufteilung erfolgte nur in Teilen der Ketten A/a, C/c und D/d. Die Gründe und die Population der Komponenten zu jedem verwendeten Zeitpunkt werden im Abschnitt Schätzung der Populationsverteilung zu jedem Zeitpunkt beschrieben. In jedem Datensatz wird das primäre Konformer (definiert als das Zwischenprodukt, das von S3 nach S0 vorrückt) mithilfe einer Strategie der reziproken xyz + isotropen B-Faktor-Verfeinerung verfeinert. Für die sekundären/tertiären Komponenten (deren Strukturen bekannt sind, da sie sich entweder im S3- oder S0-Zustand befinden) werden nur die Faktoren der Gruppe B angepasst (group_adp-Strategie in phenix.refine), um sie an die Auflösung des Datensatzes anzupassen. Für den verbleibenden Teil des Modells, der nicht geteilt ist, werden für mehrere Zyklen eine regelmäßige reziproke xyz-Verfeinerung und eine isotrope B-Faktor-Verfeinerung gleichzeitig durchgeführt. Alle Wässer (mit Ausnahme der an die OEC gebundenen Endwässer, d. h. W1–W4) wurden als einzelne Komponente verfeinert.

Die Verfeinerung des OEC in der Hauptkomponente des Mehrkomponentenmodells erfolgte mithilfe benutzerdefinierter Einschränkungen, die zur Modellierung des S3-Zustands verwendet wurden. Allerdings verwendeten wir für alle Zeitpunkte etwas lockerere geschätzte sd-Werte für die Beschränkungen (0,1 Å für Bindungen, 10° für Winkel), um den OEC-Atomen während der Verfeinerung zu ermöglichen, sich dorthin zu bewegen, wo die Elektronendichte optimal modelliert ist, und die Spannung zu reduzieren die Verfeinerung bei gleichzeitiger Beibehaltung der Gesamtform des Clusters. Der OEC im S0-Zustand wurde mit Einschränkungen modelliert, die für unsere zuvor veröffentlichte S0-Zustandsstruktur verwendet wurden. Die zur Modellierung der OEC-Atome zu den Zeitpunkten verwendeten Einschränkungen wurden als Textdateien bereitgestellt (Schemata 1–3 in den Zusatzdaten).

Die S-Zustandspopulationsverteilung im S3→S0-Übergang ist eine heterogene Verteilung, bestehend aus (1) Zentren, die vom S3- zum S0-Zustand vorrücken, (2) Zentren, die um einen Übergang zurückbleiben und daher vom S3- zum S0-Zustand vorrücken S2- in den S3-Zustand und (3) Zentren, die in den S0-Zustand übergegangen sind. Während sich die Mehrzahl der Zentren aufgrund der intrinsischen Ineffizienzen („Fehler“) des Kok-Zyklus in PS II20 in Kategorie (1) befinden, gehört ein bestimmter Anteil der Zentren zur Kategorie (2). Darüber hinaus wird nach einer bestimmten Zeit des S3-S0-Übergangs eine beträchtliche Anzahl von Zentren den stabilen S0-Zustand gebildet haben (Kategorie (3)).

Vor diesem Hintergrund ist es wichtig, diese Populationsheterogenität in unserer Strukturmodellierung zu berücksichtigen, um genaue Elektronendichtekarten und -modelle zu erhalten. Wir tun dies, indem wir unser Strukturmodell in der Nähe der Region des aktiven Zentrums (einschließlich des OEC) in mehrere Komponenten aufteilen. Die Hauptkomponente in jedem Datensatz ist Kategorie (1), die den Zwischenübergang von S3 zu S0 darstellt. Die Art der sekundären und tertiären Komponenten hängt vom betrachteten Datensatz ab. In jedem Datensatz werden nur die Koordinaten/isotropen B-Faktoren der Primärkomponente verfeinert (Kategorie (1)). Die sekundären und tertiären Komponentenstrukturen werden anhand bekannter oder zuvor hinterlegter Strukturen modelliert und nur mithilfe einer Gruppen-B-Faktor-Verfeinerung an die Auflösung angepasst. Die Identität der sekundären (und ggf. tertiären) Komponente hängt davon ab, welcher Zeitpunkt verarbeitet wird. Beispielsweise wird im 3F(50 µs)-Datensatz ein Zweikomponentenmodell erstellt, wobei die 2F(50 µs)-Modellkoordinaten/B-Faktoren für die Sekundärkomponente verwendet werden. In den 3F(1.200 µs)-Daten verwenden wir ein Dreikomponentenmodell, wobei die sekundären und tertiären Komponenten die Zustände S0 und S3 sind. Die Populationen für jede der Komponenten zu den verschiedenen Zeitpunkten sind in der erweiterten Datentabelle 3 angegeben. Wir haben in der Literatur verfügbare Zahlen verwendet, um eine kinetische Analyse durchzuführen, die eine Schätzung der Populationsverteilung ergab. Da Populationen unter 10 % zur strukturellen Verfeinerung im Rauschpegel liegen, haben wir unsere Populationen angepasst, um Konformere mit so niedrigen Populationen zu vermeiden.

Die Populationsverteilung in jedem der metastabilen S-Zustände wurde zuvor mithilfe der MIMS-Technik bestimmt. In unserer Arbeit besteht der anfängliche 2F-Zustand, der durch Beleuchten mit zwei sichtbaren Lasern mit einem Blitzintervall von 200 ms erzeugt wird, basierend auf an Kristallen durchgeführten Studien zu etwa 65 % aus S3-Zustand und 35 % S2-Zustand. Mit dem dritten sichtbaren Blitz wird der Übergang S3→S0 eingeleitet. Der Leser wird auf die erweiterten Daten in Lit. verwiesen. 4 für weitere Details dazu, wie die S-Zustandspopulationen für jeden der Blitzzustände geschätzt wurden, unter Berücksichtigung von aus XES- und MIMS-Daten berechneten Fehlparametern und Querbeleuchtung (diese war bei der Geschwindigkeit des Bandes und der Ablagerungsfrequenz des akustischen Tröpfchens vernachlässigbar). Auswurf, der in der vorliegenden Studie verwendet wurde). Alle in diesem Artikel beschriebenen Ergebnisse stammen von Monomer I (Ketten werden in den veröffentlichten Strukturen in Großbuchstaben angegeben). Ähnliche Trends werden für Monomer II beobachtet (Ketten mit Kleinbuchstaben gekennzeichnet).

Der Mn1-Mn4-Abstand bleibt bis 3F (1.200 µs) im Zwischenprodukt, das den S3→S0-Übergang durchläuft, verlängert, danach ist in den nächsten 3 ms eine Abnahme zu beobachten. Wir testeten die Robustheit des verlängerten Abstands bei 3F (1.200 µs), indem wir eine alternative Hypothese zur Erklärung dieser Beobachtung aufstellten und postulierten, dass sie auf zwei getrennte Populationen in der Primärkomponente zurückzuführen sein könnte: (1) vergrößerter Mn1–Mn4-Abstand aufgrund von Fehlschlägen die zusätzliches S3 oder (2) einen verringerten Mn1–Mn4-Abstand bilden (mit/ohne Verschwinden von Ox), was eine Eigenschaft des Zwischenprodukts ist, das den S3→S0-Übergang durchläuft. Wir haben dieses Szenario modelliert, indem wir die S3-Population im 3F-Zeitpunkt (1.200 µs) von 35 auf 55 % erhöht und die Primärkomponente (mit/ohne Ox) von 40 auf 20 % verringert haben. Die resultierende Verfeinerung ergab Mn1–Mn4-Abstände von 5,14 Å (mit Ox) und 5,09 Å (ohne Ox). Beide Zahlen ähneln dem in Abb. 3 angegebenen Abstand und liegen innerhalb des Messfehlers. Die Tests zeigen somit keine Kontraktion im Vergleich zum S3-Zustand und erlauben uns, die Hypothese zurückzuweisen. Wir bekräftigen, dass die Schätzung der S3-Population von 35 % zum Zeitpunkt 3F (1.200 µs) anhand mehrerer unabhängiger Experimente, wie im vorherigen Abschnitt und in früheren Veröffentlichungen beschrieben, gut etabliert ist.

Um die Positionsgenauigkeit der OEC-Atome und der umgebenden Aminosäuren für jeden Zeitpunkt abzuschätzen, verwendeten wir das END/RAPID-Verfahren60, ähnlich dem, was zuvor verwendet wurde6. Kurz gesagt, bei dieser Methode stören wir die Strukturfaktoren um einen zufälligen Betrag zwischen ±(mFobs − DFcalc). Die Atomkoordinaten des endgültigen Modells für diesen Zeitpunkt werden ebenfalls um einen kleinen Betrag gestört, damit das Modell einen größeren Phasenraum erkunden kann (nur das primäre Konformer wird gestört). Anschließend werden für jeden Zeitpunkt 100 solcher synthetischen Datensätze generiert und anschließend jeweils separat verfeinert. Aus dem Ensemble dieser verfeinerten Datensätze können wir den Fehler abschätzen, der mit der interessierenden Distanzmetrik verbunden ist. Die erhaltenen Fehler sollten als Obergrenze betrachtet werden, da die eingeführten Störungen in den Strukturfaktoren eine Überschätzung der wahren Fehler im Experiment darstellen.

Details zur Implementierung finden Sie unter https://bl831.als.lbl.gov/END/RAPID/end.rapid/Documentation/end.rapid.Manual.htm.

Alle im Manuskript gezeigten mFobs − DFcalc Omit-Karten wurden mit dem Programm phenix.polder und unter Verwendung der normalen Omit-Map-Koeffizienten aus der Datei „output.mtz“ (nicht der Polder-Map-Koeffizienten)61 generiert. Für die Berechnung der Peakhöhe haben wir, wo immer angegeben, benutzerdefinierte Python-Skripte verwendet, die den mFobs − DFcalc omit-Kartenwert über einen Radius von 0,5 Å um das interessierende Atom mitteln.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Atomkoordinaten und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank www.pdb.org hinterlegt (PDB-Codes 8EZ5 für die 2F-Daten; 8F4D für die 3F-Daten (50 μs); 8F4E für die 3F-Daten (250 μs); 8F4F). für die 3F(500 μs)-Daten; 8F4G für die 3F(730 μs)-Daten; 8F4H für die 3F(1.200 μs)-Daten; 8F4I für die 3F(2.000 μs)-Daten; 8F4J für die 3F(4.000 μs)-Daten; 8F4K für die 3F(200 ms)-Daten und 8F4C für die 2F-alternativen Daten). Die Rohdaten des Freie-Elektronen-Röntgenlasers wurden in der Coherent X-Ray Imaging Database, www.cxidb.org (ID 215), hinterlegt.

Die Open-Source-Programme dials.stills_process, cctbx.xfel GUI, cctbx.xfel.stripe_experiment, cctbx.xfel.merge und das Legacy-Programm cxi.merge werden mit DIALS-Paketen vertrieben, die unter http://dials.github.io verfügbar sind. Anweisungen und Details zur Verwendung dieser Programme finden Sie in den Referenzen. 56,57 mit weiterer Dokumentation verfügbar unter http://cci.lbl.gov/xfel. Die in der Arbeit gezeigten Abbildungen wurden mit der PyMOL-Software v.2.5 (Lit. 62) gerendert. Benutzerdefinierter Code zur Berechnung der Spitzenhöhenwerte ist öffentlich verfügbar unter https://github.com/asmit3/eden (Ref. 63).

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Referenzen herunterladen

Wir danken K. Sauer (1931–2022) für sein Interesse an dieser Forschung und für viele Diskussionen über die photosynthetische Wasseroxidation. Wir danken R. Massad, M. Kretzschmar, P. Sinnott, J. Blaschke, A. Britz, S. Carbajo, C. de Lichtenberg, L.-C. Kao, L. Lassalle, D. Liebschner, D. Mendez, F. Moss, E. Pastor, C. Pham, B. Poon, KD Sutherlin und ID Young für Unterstützung bei der Probenvorbereitung, Datenerfassung und -verarbeitung. Wir danken den Supportmitarbeitern von LCLS/SLAC, SACLA/Japan, SSRL und ALS. Diese Arbeit wurde vom Direktor, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences (OBES), Division of Chemical Sciences, Geosciences, and Biosciences of the Department of Energy (DOE) (JY, VKY und JK) für Röntgenspektroskopie unterstützt Die Sammlung und Analyse von Kristallographiedaten sowie die Methodenentwicklung für Photosynthesesysteme wurden von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt; Zuschüsse GM055302 (VKY) für die Photosystem-II-Biochemie, GM110501 (JY) und GM126289 (JK) für die Instrumentenentwicklung für Röntgenstrahlen Freie-Elektronen-Laser-Experimente (XFEL) und GM117126 (NKS) zur Entwicklung von Berechnungsprotokollen für XFEL-Daten). NKS dankt für die Unterstützung des Exascale Computing Project (Förderung 17-SC20-SC), einer Gemeinschaftsinitiative des DOE Office of Science und der National Nuclear Security Administration. Deutschlands Exzellenzstrategie (Projekt EXC 2008/1-390540038 (AZ, HD und SH)), koordiniert von der TU Berlin und der Deutschen Forschungsgemeinschaft über den Sonderforschungsbereich SFB1078 (Humboldt-Universität zu Berlin), TP A5 (AZ, HD, MI, RH und JG) und Vetenskapsrådet (Zuschüsse 2016-05183 (JM) und 2020-03809 (JM)) sowie Energimyndigheten (Zuschuss 45421-1 (JM)) danken wir für ihre Unterstützung. RH dankt für die Unterstützung durch ein Caroline von Humboldt-Stipendium der Humboldt-Universität zu Berlin. CJK dankt dem NIH für seine Unterstützung (NRSA-Stipendium F32GM142218). Diese Forschung nutzte Ressourcen von NERSC, einer User Facility, die vom Office of Science, DOE (Vertrag DE-AC02-05CH11231) unterstützt wird. XFEL-Daten wurden am LCLS/SLAC, Stanford und SACLA, Japan, gesammelt. Die XFEL-Experimente am SACLA wurden mit Genehmigung des Japan Synchrotron Radiation Research Institute (Vorschläge 2018B8089, 2019A8081 und 2019B8067) am BL2 durchgeführt. Die Tests von Kristallen und verschiedenen Teilen des Aufbaus wurden in Synchrotronanlagen durchgeführt, die von der ALS in Berkeley und der SSRL in Stanford bereitgestellt und vom DOE OBES finanziert wurden. Das SSRL Structural Molecular Biology Program wird vom DOE OBER und dem NIH unterstützt (Zuschuss P41GM103393). Die Nutzung des LCLS und SSRL, SLAC National Accelerator Laboratory wird vom DOE, Office of Science, OBES (Vertrag DE-AC02-76SF00515) unterstützt, und strukturbiologische Arbeiten am LCLS werden vom NIH (Zuschuss P41GM139687; der Rayonix-Detektor) unterstützt wurde durch den Zuschuss S10 OD023453 finanziert).

Mohamed Ibrahim

Aktuelle Adresse: Institut für Molekulare Medizin, Universität zu Lübeck, Lübeck, Deutschland

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Asmit Bhowmick, Rana Hussein, Isabel Bogacz, Philipp S. Simon

Abteilung für Molekulare Biophysik und integrierte Biobildgebung, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA

Asmit Bhowmick, Isabel Bogacz, Philipp S. Simon, Ruchira Chatterjee, Margaret D. Doyle, In-Sik Kim, Hiroki Makita, Medhanjali Dasgupta, Corey J. Kaminsky, Miao Zhang, Isabela I. Nangca, Stephen M. Keable, James M .Holton, Daniel W. Paley, Nigel W. Moriarty, Paul D. Adams, Aaron S. Brewster, Nicholas K. Sauter, Jan Kern, Junko Yano und Vittal K. Yachandra

Department of Biology, Humboldt Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Rana Hussein, Mohamed Ibrahim, Julia Gätcke, Stephanie Haupt, Holger Dobbek & Athina Zouni

Molekulare Biomimetik, Fachbereich Chemie – Ångström, Universität Uppsala, Uppsala, Schweden

Mun Hon Cheah, Petko Chernev, A. Orkun Aydin, Fikret Mamedov und Johannes Messinger

Abteilung für Theoretische Chemie und Biologie, KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Schweden

Thomas Fransson

Japanisches Forschungsinstitut für Synchrotronstrahlung, Hyogo, Japan

Kensuke Tono & Shigeki Owada

RIKEN SPring-8 Center, Hyogo, Japan

Kensuke Tono & Shigeki Owada

Linac Coherent Light Source, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, CA, USA

Leland B. Gee, Franklin D. Fuller, Alexander Batyuk und Roberto Alonso-Mori

Abteilung für Biochemie und Biophysik, University of California, San Francisco, CA, USA

James M. Holton

SSRL, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, CA, USA

James M. Holton

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of California, Berkeley, CA, USA

Paul D. Adams

Fachbereich Physik, University of Wisconsin–Madison, Madison, WI, USA

Uwe Bergmann

Fakultät für Chemie, Universität Umeå, Umeå, Schweden

Johannes Messinger

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RA-.M., NKS, UB, AZ, JM, JK, JY und VKY haben das Experiment entworfen. Von RH, MI, RC, MD, MZ, JG, SH, IIN, AZ und JK vorbereitete Proben. RC, MHC, TF, JG, SH, AOA und FM charakterisierten die Probenaktivität. KT, SO, LBG, FDF, A.Batyuk und RA-.M. bereitete die Strahllinien des Freie-Röntgen-Lasers (XFEL) vor und betrieb sie. IB, PSS, PC, I.-SK, HM, FDF und JK haben das Probenabgabesystem entwickelt, getestet und betrieben. A. Bhowmick, RH, IB, PSS, MI, RC, MDD, MHC, TF, PC, I.-SK, HM, MD, CJK, MZ, JG, SH, SMK, KT, SO, LBG, FDF, A .Batyuk, RA-.M., DWP, ASB, NKS, UB, AZ, JM, JK, JY und VKY führten das XFEL-Experiment durch. A.Bhowmick, JMH, DWP, NWM, PDA, ASB und NKS entwickelten neue Software für die Datenverarbeitung. A.Bhowmick, MD, SMK, DWP, ASB und NKS verarbeiteten XFEL-Daten. A.Bhowmick, RH, IB, PSS, MI, MDD, HD, NKS, AZ, JM, JK, JY und VKY analysierten und interpretierten Daten. A.Bhowmick, RH, IB, PSS, MDD, AZ, JM, JK, VKY und JY haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Athina Zouni, Johannes Messinger, Junko Yano oder Vittal K. Yachandra.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Richard Neutze, Dimitrios Pantazis und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Zum Vergleich der Peakhöhe wird auch die Auslassungskarte des Sauerstoffatoms O2 angezeigt. Auslassungskarten für jedes Atom wurden erstellt, indem das Atom in jedem Datensatz nur im Primärkonformer einzeln weggelassen wurde. Die Karten werden auf Höhenlinien von 2,5, 3 und 4σ angezeigt. (a) Lassen Sie Karten von OX, O5 und O2 weg. (b) Lassen Sie Karten von W1, W2, W3, W4 und O2 weg. Im Vergleich zur O2-Referenz-Omit-Map wird zwischen 730 und 2000 µs eine deutliche Verringerung der Spitzenhöhe der Auslassungskarte von OX, O5, W1, W2, W3 und W4 beobachtet.

Die Karte wird auf einer Konturebene von 2,5σ (in Gelb) angezeigt. Auf diesem Niveau zwischen W3 und W4 wird eine Elektronendichte beobachtet (siehe roter Pfeil), was möglicherweise auf eine vorübergehende Wasserbewegung hinweist, die auch durch die Überlappung der ausgelassenen Kartendichten bestätigt wurde. Zum Vergleich sind auch die einzelnen Auslassungskarten von W3 und W4 bei 2,5, 3 und 4σ überlagert (Farbschema wie in Abb. 2 im Haupttext). Eine stärkere Elektronendichte wird auch um W1/D61 beobachtet, was möglicherweise mit einer Bewegung zusammenhängt, die einen Protonentransfer beinhaltet, wie im Haupttext zu Abb. 2 diskutiert. Die Elektronendichte um O1 hängt möglicherweise mit Veränderungen zusammen, die in W26-W30 beobachtet wurden (bezeichnet als). der „Wasserrad“-Region) zu diesem Zeitpunkt (im Haupttext zu Abb. 4 besprochen).

Zum Vergleich wird die B-Faktor-Verteilung aller Kanalgewässer für jeden Zeitpunkt überlagert. Die Y-Achsenwerte der Markierungspunkte für die 4 Gewässer sind lediglich Platzhalter. Es gibt eine starke Verschiebung der relativen B-Faktor-Werte von W27, W28 und W32 im 3F-Zeitpunkt (1200 µs), der mit dem Verschwinden von OX zusammenfällt.

Ergänzende Tabellen 1 und 2.

Dieser komprimierte Ordner enthält die Ergänzungsschemata 1–3: Einschränkungen zur Modellierung des OEC im S3→S0-Übergang.

Video, das die verschiedenen Änderungen am OEC beim S3→S0-Übergang zeigt. Hochauflösende Version verfügbar unter: https://drive.google.com/file/d/1d4fMKBcYUdenqajlXo3J-a8lU5eaUxe3/view?usp=share_link.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bhowmick, A., Hussein, R., Bogacz, I. et al. Strukturelle Hinweise auf Zwischenprodukte bei der O2-Bildung im Photosystem II. Natur 617, 629–636 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06038-z

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Eingegangen: 18. November 2022

Angenommen: 31. März 2023

Veröffentlicht: 03. Mai 2023

Ausgabedatum: 18. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06038-z

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